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ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而它作為經(jīng)典的免疫檢測方法，雖然看似平常但是要真正將該實(shí)驗(yàn)做好并不容易，酶標(biāo)板的讀值總是會(huì)不盡如人意，可見實(shí)操中的各個(gè)環(huán)節(jié)對該實(shí)驗(yàn)的檢測效果影響較大，如不注意，就會(huì)產(chǎn)生一些糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。跟小源一起來總結(jié)一下ELISA空白背景高的常見原因和處理方法吧!常見原因有以下這些：1）洗板不干凈解決方法：①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對照會(huì)顯色，嘗試延長洗板時(shí)間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活...

ELISA實(shí)驗(yàn)的具體步驟

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，簡寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。ELISA是分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中常用到的實(shí)驗(yàn)操作之一，一起來了解一下ELISA實(shí)驗(yàn)的具體步驟吧！1.涂覆：將待檢測的抗原或抗體溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一層固定的抗原或抗體。這個(gè)過程被稱為涂覆。2.阻斷：為了防止非特異性結(jié)合，需要在...

怎么選擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染呢？

轉(zhuǎn)染是將外源性核酸（DNA或RNA）采用各種化學(xué)、生物學(xué)或物理方法導(dǎo)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞基因功能的蛋白質(zhì)表達(dá)研究。生成重組蛋白，或特異性地增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因表達(dá)是轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的主要目的。因此，轉(zhuǎn)染是一種功能強(qiáng)大的分析工具，可用于基因或基因產(chǎn)物的功能和調(diào)控研究，用于生成轉(zhuǎn)基因生物，并可用作基因治療方法。常規(guī)的轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，怎么選擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染呢？選擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，具體取決于您要開展的實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍和最終目標(biāo)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞一般在轉(zhuǎn)染后24...

如何利用PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞呢？

轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有很多，這里介紹一種比較經(jīng)濟(jì)實(shí)用的轉(zhuǎn)染試劑--聚乙烯亞胺(即PEI)。PEI（polyethylenimine）是一種帶有高電荷陽離子的多聚物，非常容易結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA分子，形成復(fù)合物，并轉(zhuǎn)染到貼壁和懸浮細(xì)胞中，常用于大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)。在HEK293和CHO等細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較高。那么如何利用PEI轉(zhuǎn)染細(xì)胞呢？實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：PEI(polysciences,Cat#:24765-1),將PEI配置成1ug/ml，用0.2μm濾膜過濾，并分裝儲(chǔ)存于負(fù)80度。實(shí)驗(yàn)...

免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟

Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項(xiàng)技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.鋪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本次轉(zhuǎn)染的兩個(gè)蛋白分別帶有FLAG和HA標(biāo)簽。裂解細(xì)胞2.去除培養(yǎng)基，PBS吹下細(xì)胞，離心去上清。將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，PBS洗，離心去上清，加1ml裂解液。3.冰上孵育40min，每10min震蕩一次。4.超聲破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)和打斷染色質(zhì)。冰...

Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項(xiàng)

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，有許多常用的轉(zhuǎn)染試劑。下面簡單介紹下Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：Lipofectamine™3000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM（可以用無血清的培養(yǎng)基代替）實(shí)驗(yàn)步驟：1.接種細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70–90%匯合度。注：對于HEK293，6孔板一般鋪50萬個(gè)細(xì)胞左右。對于PC9,24孔板一般鋪5-10萬個(gè)細(xì)胞。由于不同細(xì)胞，生長狀況不太一樣，需要根據(jù)情況調(diào)整。2.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋Lipofectami...

啟動(dòng)子有哪些特征？

啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’-端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性?；虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄取決于酶與啟動(dòng)子能否有效地形成二元復(fù)合物。那啟動(dòng)子有哪些特征？①序列特異性。在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框，序列框中堿基的變化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性的改變。②方向性。啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，有單向啟動(dòng)子和雙向啟動(dòng)子兩類。③位置特性。啟動(dòng)子一般位于所啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因的上游或基因內(nèi)的前端。處于基因的下游或在基因的上游但離...

PCR體系及各類常見PCR辨析

聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction)簡稱PCR，是一種體外高效擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)明人是KaryMullis，他從1983年開始研究PCR技術(shù)，1985年開始被逐漸采用，成為分子生物學(xué)的一項(xiàng)常規(guī)手段，并得到了廣泛的應(yīng)用，在臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義。PCR是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓需要擴(kuò)增的DNA片段變性解鏈成兩條單鏈，人工合成的一對引物讓它們結(jié)合到DNA模板（分別結(jié)合到兩條鏈上...